Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi air kelapa dan 2.4-D terhadap pertumbuhan kalus dari eksplan tebu dalam kultur jaringan agar menghasilkan kalus yang lebih baik. Penelitian dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan Institut Pertanian Stiper Yogyakarta yang terletak di Jl. Petung No.2 paringan. Yogyakarta. Penelitian dilakukan mulai bulan Maret 2012 sampai dengan bulan Juli 2012. Penelitian dilaksanakan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (CRD). Pola faktorial ini digunakan dua faktor: Faktor I : Pemberian air kelapa yang terdiri dari 4 aras konsentrasi yaitu: A0 : Pemberian air kelapa 0 ml/l ( tanpa air kelapa) A1 : Pemberian air kelapa 50 ml/l. A2 : Pemberian air kelapa100 ml/l. A3 : Pemberian air kelapa 150 ml/l. Faktor II : Pemberian 2,4 D yang terdiri dari 4 aras konsentrasi yaitu: D0 : Konsentrasi 2,4-D 0 ppm. D1 : Konsentrasi 2,4-D 2 ppm. D2 : Konsentrasi 2,4-D 4 ppm. D3 : Konsentrasi 2,4-D 6 ppm. Kesimpulan dari penelitian ini membuktikan bahwa Ada interaksi nyata antara konsentrasi 2,4-D + air kelapa terhadap saat kalus mulai tumbuh. Adapun hasil terbaik diperoleh dari kombinasi perlakuan 2,4-D 4 pmm + air kelapa 50 ml/l. Tidak ada interaksi yang nyata antara konsentrasi 2,4-D + air kelapa terhadap berat segar kalus tebu. Ada interaksi nyata antara konsentrasi 2,4-D + air kelapa terhadap warna kalus tebu. Adapun hasil terbaik diperoleh dari kombinasi perlakuan 2,4-D 2 pmm dan air kelapa 50 ml/l.