Penurunan kualitas air sungai akibat aktivitas manusia menjadi sebuah permasalahan yang harus diberi perhatian lebih, Sungai Opak sebagai salah satu sungai utama di Daerah Istimewa Yogyakarta terancam kesehatannya akibat limbah domestik, pertanian, dan industri. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kesehatan ekosistem Sungai Opak dengan menggunakan makroinvertebrata sebagai bioindikator yaitu EPT(Ephemeroptera, Plecoptera dan Trichoptera). Metode yang digunakan adalah biomonitoring dengan teknik pengambilan sampel kick sampling dan jab sampling di tiga stasiun sepanjang aliran sungai. Analisis dilakukan dengan menghitung keragaman jenis famili, keragaman jenis EPT, % kelimpahan EPT, dan indeks biotilik. Faktor lingkungan seperti suhu, pH, dan TDS berpengaruh signifikan terhadap distribusi makroinvertebrata. Hasil penelitian menunjukkan bahwa keberagaman makroinvertebrata di Sungai Opak terdiri dari 15 famili. Nilai dari keempat parameter dirata-ratakan dengan skor 4 untuk mendapatkan indikator keterangan indeks biotilik yang hasilnya stasiun hulu skor 2 berarti tercemar sedang, stasiun tengah skor 1,5 berarti tercemar berat, dan stasiun hilir skor 1,25 berarti tercemar berat. Sehingga status kesehatan sungai menurun dari hulu ke hilir yang mengindikasikan kualitas air dari kategori tercemar sedang hingga tercemar berat. Kondisi kesehatan sungai ditentukan oleh keberadaan makroinvertebrata dan nilai indeks biotik, di mana dominasi organisme sensitif mencerminkan sungai yang sehat, sedangkan dominasi organisme toleran menunjukkan sungai yang tidak sehat atau terdegradasi. Kualitas air Sungai Opak memerlukan perhatian khusus untuk pengelolaan dan konservasi ekosistem sungai berkelanjutan.