Biskuit merupakan salah satu olahan terigu yang digemari oleh masyarakat luas. Tepung dari bahan dasar singkong memiliki kandungan yang relatif sama dengan tepung terigu, dan berpotensi menjadi pengganti terigu. Ampas kopi merupakan limbah hasil penyeduhan kopi yang biasanya hanya dibuang, padahal masih mengandung rasa dan aroma serta kandungan yang sama dengan bubuk kopi. Tujuan dari penelitian ini untuk mempelajari pengaruh jenis tepung subtitusi terhadap sifat fisik, kimia, dan organoleptik pada biskuit, mempelajari pengaruh penambahan ampas kopi terhadap sifat fisik, kimia, dan organoleptik pada biskuit, dan menentukan jenis tepung subtitusi dan penambahan ampas kopi yang menghasilkan biskuit paling disukai panelis. Penelitian ini menggunakan rancangan blok lengkap (RBL), dengan dua faktor yaitu jenis tepung subtitusi 45% (A) dan persentase penambahan ampas kopi (B) dilakukan pengulangan 2 kali. Taraf faktor A yaitu A1 = tepung tapioka, A2 = tepung mocaf, dan A3 = tepung gaplek. Adapun taraf faktor B yaitu B1 = 0%, B2 = 5%, dan B3 = 10%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jenis tepung subtitusi berpengaruh terhadap kadar air, protein, serat kasar, dan tekstur kekerasan, sedangkan penambahan ampas kopi berpengaruh terhadap kadar air, kadar protein, kadar serat kasar, tekstur kekerasan, dan warna. Biskuit paling disukai panelis adalah biskuit perlakuan A3B2 (subtitusi tepung gaplek dan penambahan ampas kopi 5%) dengan nilai 6,17 (suka), kadar air 5,11%, kadar protein 5,23%, dan kadar lemak 13,83%, serta serat kasar 0,62%.